Probes for reactive oxygen species（活性氧ROS探針）技術專題

Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素

Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素

專題關鍵詞：

Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物質；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；

基本描述：

氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）是由T. Nagano開發的兩種活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示劑，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更優秀的特異性和穩定性。APF和HPF顯示有限的非選擇性反應，和相對較高的光誘導氧化抗性。APF和HPF具細胞膜滲透性，本身無熒光，直到與羥基自由基或過氧亞硝基陰離子反應，還能與次氯酸陰離子反應，產生強綠色熒光（Ex/Em，~490/515nm），可用熒光顯微鏡、高通量成像儀、熒光酶標板或流式細胞儀檢測。

工作原理：

中性溶液中氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）幾乎是無熒光，當與高活性氧物質（highly reactive oxygen species, hROS）反應，能夠生成具有高熒光強度的熒光素（Ex/Em, 490/515nm），且能觀察到熒光強度的增加【見下反應原理圖】。

探針特征：

□  APF，HPF選擇性檢測hROS比如羥基自由基（HO?）和過氧亞硝基陰離子（ONOO–），但不會與其他活性氧物質反應（?O2–,1O2, H2O2, NO等）；

□  通過加入辣根過氧化物酶（HRP）能定量測定過氧化氫H2O2;

□  結合使用HPF和APF能特異性檢測次氯酸（OCl-）;

□  HPF和APF本身根本不會自氧化，從而與其他試劑相比能得到更可靠的數據；

□  能對活細胞進行成像檢測；

ROS探針檢測特異性比較：

□  試劑配制：1mg HPF/APF分別溶于DMF配制成5mM儲存液。使用前用磷酸鹽溶液（0.1M, pH 7.4）稀釋500~5000倍（10～1μM）。將稀釋液加入樣本并孵育，然后測定熒光值（Ex/Em, 490/515nm）。

□  磷酸鹽緩沖液體系（0.1M, pH 7.4），每一種熒光試劑（終濃度：10μM，0.1% DMF用作共溶劑）與各種活性氧物質反應。

□  HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的熒光強度測定。

表1. 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對各種活性氧物質的反應特異性

ROS探針應用示例：

示例1：細胞經光誘導的自氧化檢測（Light-induced autoxidation in cells）

1.1    探針加量：37℃避光孵育細胞30min，HPF或DCFH-DA（10μM each）

1.2    熒光測定：共聚焦顯微鏡觀察熒光（激發波長488nm，檢測波長＞515nm）；488nm波長輻射刺激細胞10s，然后再測定熒光。

1.3    實驗圖片：

示例2：豬中性粒細胞的體內成像（Bioimaging of porcine neutrophils）

2.1 豬中性粒細胞的純化

a）從豬血中純化中性粒細胞；b）將純化的中性粒細胞溶于KRPD緩沖液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上直至使用。將其轉移到培養皿內。

2.2 探針加載與PMA刺激

a）加10μM HPF或APF到細胞，室溫孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒細胞；

2.3 中性粒細胞的體內成像

刺激前或刺激后10min用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細胞（激發波長488nm，觀察波長505nm-550nm）。

 圖. 中性粒細胞次氯酸陰離子（OCl-）檢測。同時加載兩個樣品，一個用HPF檢測，另一個用APF檢測。OCl-的生成通過APF檢測能看到熒光增強，通過HPF檢測幾乎看不到熒光變化。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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