Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑

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產品標簽

CCK-8細胞增殖及毒性檢測;WST-8；MTT 噻唑蘭；Alamar Blue 阿爾瑪藍；XTT；WST-1；

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產品描述

Cell Counting Kit (CCK-8)，中文名CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑，簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學名為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的一種廣泛應用于細胞增殖和毒性檢測的快速高靈敏度試劑盒。

WST-8是MTT（噻唑蘭）的升級產品，檢測原理（見下圖）為：在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物（formazan）。顏色的深淺與活細胞數量（細胞增殖）成正比，與細胞毒性成反比。通過酶標儀在450nm波長處測定OD值來反映細胞增殖，以及細胞毒性水平。

CCK-8法應用非常廣泛，包括藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

保存與運輸方法

保存：2-8℃避光保存，一年有效。-20℃避光保存，二年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   第一次做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。

2）   接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來導致每孔中的細胞數量不等，可以每接種幾個孔就混勻一下。培養板周圍一圈孔培養基容易揮發，為減少誤差，建議培養板的四邊每孔只加培養基，而不作為指標檢測孔。

3）  培養時間根據細胞種類不同和每孔內細胞數量的多少而異。一般情況白細胞較難顯色，因此需要較長的CCK-8反應時間或增大細胞數量（~105個細胞/孔）。懸浮細胞比貼壁細胞較難顯色，對于懸浮細胞，加入CCK-8培養1-4小時后，可先從培養箱中取出，目測染色程度或用酶標儀測定來決定。若顯色困難，可將培養板放回培養箱，繼續培養數小時后再確定。對于貼壁細胞，CCK-8的培養時間一般為1-4小時，但培養30分鐘左右可取出肉眼觀察顯色程度（根據細胞類型而定，需要摸索一定條件）。注意：CCK-8的最佳反應時間以實際顯色的最佳時間為準。

4）   有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加，容易產生氣泡，會干擾OD值讀數。

5）   加CCK-8速度要快，減少試劑在移液器上的殘留。為使CCK-8試劑和培養基充分混勻，建議在加入CCK-8后輕輕震搖培養板。為了避免加樣時由于CCK-8在槍頭上殘留所引入的誤差，可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8并混勻后加樣。

6）   CCK-8的核心成分WST-8會與還原劑反應生成WST-8甲臢，若實驗體系內含有還原劑，請務必檢測背景OD值（即在不含細胞的培養基中加入藥物，然后加入CCK-8在一定時間內檢測）和不加藥物的培養基（只加CCK-8）進行比較。如果OD值明顯偏高，則說明的確存在反應。

7）   若細胞培養時間較長，培養基顏色發生變化或pH發生變化，建議更換新鮮的培養基后再加入CCK-8。含酚紅的培養基不影響CCK-8測定細胞活性。

8）   如果樣品為高渾濁的細胞懸液，建議設定600nm（或600nm以上）作為參比波長，扣除參比波長的OD值即可。

9）   CCK-8對細胞毒性非常低，其與活細胞脫氫酶持續反應使溶液顏色不斷加深，OD值不斷增加（由于脫氫酶是持續產生的）。另外，其他實驗比如中興紅法或結晶紫法，也可在CCK-8檢測完成后繼續進行。

10）若需要測定細胞的具體數量，建議先做一個標準曲線。

11）如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

12）關于CCK-8的更多問題，請見附錄I. CCK-8使用常見問題集錦。

13）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.      制作標準曲線（測定細胞具體數量）

1）   先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞到培養板內。

2）   按比例（例如：1/2比例）依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。

3）   接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養時間。）

2.      細胞活性檢測

1）   在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養一段時間（37℃，5% CO2）。

2）   向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

3）   將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

4）   用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5）   若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

3.      細胞增殖-毒性檢測

1）   在96孔板中配制100μL的細胞懸液。將培養板放在培養箱預培養24小時（37℃，5% CO2）。

2）   向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

3）   將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24或48小時）。

4）  向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

5）   將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

6）   用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7）   若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

【注意】：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

活力計算

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：實驗孔（含有細胞的培養基、CCK-8溶液和藥物）的吸光度
A（空白）：空白孔（不含細胞和藥物的培養基，含CCK-8溶液）的吸光度
A（0加藥）：對照孔（含有細胞的培養基、CCK-8溶液，不含藥物）的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性

相關產品

附錄I. CCK-8使用常見問題集錦

1）  CCK-8與其他細胞增殖-毒性檢測方法的優勢在哪里？

2）   單孔接種多少個細胞？

當使用96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μL培養基）。檢測白細胞的靈敏度相對較低，因此建議接種量不低于2500個/孔（100μL培養基），建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量。若使用24孔板或6孔板，請先計算每孔相應的接種量，然后按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8。

3）   如何設定空白對照？

在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還應考慮藥物的吸收，可以在不含細胞、加入藥物的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。

4）   哪些物質會影響CCK-8的測定？

當有還原性物質存在時會增加CCK-8的測定，增加OD值；當有氧化性物質存在時會抑制測定反應的發生，降低OD值。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

5）   做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時會有影響。如果藥物具有還原性就會和CCK-8發生顯色反應，增加OD值。解決方法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含藥物的培養基（只加CCK-8）的吸光度高，則說明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

6）   CCK-8對細胞的毒性大小如何？

CCK-8對細胞毒性相當低，同樣的細胞在CCK-8檢測后還可用于其他細胞增殖的檢測實驗，比如結晶紫檢測法，中性紅檢測法或DNA熒光檢測法等。由于每種細胞對CCK-8的耐受力不同，因此若需要長時間孵育，先檢測下細胞在加入CCK-8后的活力。

7）   如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用430-490nm之間的濾光片，但450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

8）   CCK-8能否對活細胞進行染色？

不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性四唑鹽（WST-8），并通過電子載體1-methoxy PM將活細胞中的電子交換到培養基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不會進入細胞內，所以CCK-8不能對活細胞進行染色。

9）   必須設定參比波長？設定參比波長的目的是什么？

不一定，CCK-8在參比波長處沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁產生的吸收。

10）每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能存在以下幾個原因：a）當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。通常情況最外一圈孔只加培養基，不作為測定孔用；b）有可能因為CCK-8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK-8，輕輕敲擊培養板以幫助混勻；c）每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1000~100,000個/孔范圍內摸索條件。

11）如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可采取2種辦法：a）適當增加細胞數量；b）延長加入CCK-8后的孵育時間。

12）如果OD值太高，但不能減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8后的孵育時間。比如，可以把加入CCK-8后的孵育時間由原來的3h縮短到2h。

13）CCK-8顯色過程種如何終止反應？

有以下幾種方法（96孔板）：a）顯色反應后，將培養板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應終止后請在24h內測定OD值。

14）必須預培養細胞嗎？

不一定。如果需要保持細胞的最佳狀態，建議預培養細胞。如果不做預培養，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。有的科研人員不做預培養，但做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

15）預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數板計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養后取培養基用血球計數板進行計數。

16）CCK-8對于不同的細胞靈敏度是否一樣？

不一樣。懸浮細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的染色時間或增加細胞數量來解決。

17）懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？

懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

18）應該每次做標準曲線嗎？

建議每次都做。雖然細胞相同，但是細胞狀態不一樣。對于狀態不一樣的細胞建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能有輕微的差異，此時也建議分別做標準曲線。

19）實驗之前是否需要先檢測以下培養基和CCK-8之間是否有反應？

建議使用一個孔做下檢測，因有時培養基種可能含氧化還原物質。正式實驗之前有必要先確認下培養基和CCK-8是否有反應。一般正常的OD值應該在0.4以下。

20）有時在藥物作用下，細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反應活細胞數量。如果細胞已經死亡，即使脫氫酶的活性還有，測定出來的細胞數量將會比真實值高，不能反應真實的活細胞數量，建議采用別的方法測定。

21）可否使用384孔板進行實驗？

可以。向每孔加入培養基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少，可以先將CCK-8稀釋一倍，然后加入培養基總體積20%的量。

22）CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性？

有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此，結果可能不同。

23）CCK-8能否檢測細菌細胞？

可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。向每孔100μL大腸桿菌培養液中加入10μL CCK-8，培養1-4h或過夜。

24）CCK-8的穩定性如何？

CCK-8在2-8℃能穩定保存1年，推薦用此方法檢測；長期不用也可置于-20℃穩定保存2年。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作，主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。

文獻引用：

Liu JY et al. 3D printing of biomimetic multi-layered GelMA/nHA scaffold for osteochondral defect repair. Materials & Design Volume 171, 5 June 2019, 107708

Cell counting kit-8 reagent was purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (China). Cell proliferation on the scaffold was measured with CCK-8 after 1, 3, 5 and 7 days of culture, and cell culture plates were used as blank group. The BMSCs-seeded hydrogels were incubated in DMEM containing 10% CCK-8 protected from light at an incubator of 37 °C and 5% CO2 for 4 h, and measured at 450 nm using a microplate reader.