Calcein AM/PI Double Stain Kit 活細胞/死細胞雙染試劑盒

產品關鍵詞：

Calcein, AM 鈣黃綠素AM；Calcein Red 鈣黃綠素紅；活細胞染色探針；Fluorescein diacetate (FDA)；Propidium Iodide (PI) 碘化丙啶；CAS NO：148504-34-1；

產品信息

【溫馨提示】：見我司懋康生物（maokangbio）整理的鈣黃綠素（Calcein）系列產品專題。

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產品描述

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性的活細胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水性，使其能輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發熒光。一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內鈣離子結合，產生強烈的綠色熒光。因不具有細胞膜滲透性，從而被保留在胞內。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低，而且不會抑制任何細胞功能如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實驗結果十分可信，與標準的51Cr釋放法所得結果一致。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細胞進行標記，這一特征使其非常適合用來檢測細胞活力和細胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯合使用，因其僅能穿過死細胞膜的無序區域到達細胞核，嵌入細胞的DNA雙螺旋區域，并產生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。結合這些特點，Calcein, AM和PI經常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。

本試劑盒就是結合Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據試劑盒優化體系，單次以200μl細胞懸液進行染色，分別可做500次（貨號：MX3012-500T）和1000次（貨號：MX3012-1000T）檢測。

試劑盒組分

保存與運輸方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、試劑準備

1.1 1×反應緩沖液（Assay Buffer）的配制

從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1）   先將低溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化?！咀⒁猓旱谝淮问褂脮r建議對儲存液根據單次用量分裝，特別是Calcein AM，以減少反復凍融次數?！?/span>

2）   取5μl Calcein AM溶液 (4 mM)和15μl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein AM的工作液濃度為4μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結果?！咀⒁猓喝旧ぷ饕罕仨毈F配現用，并且在當天用完?！?/span>

二、染色步驟

2.1  對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3min）。

對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。

2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3  用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×105~1×106細胞/ml。

2.4  取100μl染色工作液加入200μl細胞懸液內，混勻，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延長孵育時間至30min?！?/span>

2.5  熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。

【注意】：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a)  用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從而制備死細胞；

b)  用0.1-10μM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的最佳工作濃度。

c)  用0.1-10μM的Calcein AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

測定方法與結果呈現

1）  熒光顯微鏡（Fluorescent Microscopy）

檢測方法：490±10 nm激發能同時看到呈黃-綠色熒光的活細胞和紅色的死細胞。另，545nm激發可能只能看到呈紅色的死細胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 熒光酶標儀（Fluorescent Plate Reader）

檢測方法：96孔透明底的黑色酶標板（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測的激發波長為490nm，發射波長為520nm；PI檢測的激發波長為530nm，發射波長為617nm；

3） 流式細胞儀（Flow cytometer）

檢測方法：流式細胞儀，Calcein檢測的激發/發射波長為488/535nm，PI的激發和發射波長為488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常見問題

1、  該試劑盒適用任何細胞類型？

基本上適用于任何含酯酶活性的動物細胞。植物和細菌細胞因含有細胞壁，Calcein-AM不能進入因此無法染色。有可能對原生質體進行染色。

2、  用相同濃度有可能對所有哺乳動物細胞進行染色？

對所有細胞都用相同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工作濃度根據細胞類型差異很大。有必要根據具體細胞來確定最佳染料濃度。參考說明書染料工作濃度優化方法。

3、  Calcein-AM對細胞有毒？

與其他相似的活細胞染料比較，Calcein-AM基本無毒（毒性最?。?。見文獻EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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文獻引用：

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Zhang XX et al. Characterization and property of dual-functional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of current density. Journal of Alloys and Compounds Volume 810, 25 November 2019, 151893

After the formazan was dissolved by dimethyl sulfoxide (DMSO), the optical density (OD) was then determined using enzyme-labeled instrument (iMark, BIO-RAD, US) at the wavelength of 570 nm. To reveal the viability of adherent MC3T3-E1 cells, a Live/Dead Double Staining Kit (MKBio, China).was employed. After 1 day culture, ... stained with Calcein acetoxymethyl ester (Calcein AM) and propidium.

[2]Zheying Meng et al. Marriage of Virus-Mimic Surface Topology and Microbubble-Assisted Ultrasound for Enhanced Intratumor Accumulation and Improved Cancer Theranostics.

Calcein-AM and PI were purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

[3]

Xijian Liu et al. Facile synthesis of biocompatible cysteine-coated CuS nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for cancer therapy. Dalton Trans., 2014,43, 11709-11715

Calcein AM/propidium iodide (PI) double stain kit, propidium iodide(PI), and fluorescein isothiocyanate (FITC) were purchased from Shanghai Maokang

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 After 1, .3, and 5 days of incubation, the cells adhering to the scaffold surface were stained with a live/dead cell staining kit (MX3012-500 T, Maokangbio, China), after which the cells on the scaffold surface were observed using an inverted fluorescence microscope

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 After incubation for 6 hours, 4 μmol/L Calcein AM (Maokangbio, Shanghai, China) was added for cell staining, followed by incubation for 30 minutes.

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The HUVECs were subsequently co-cultured for 4 h with THP-1 cells that were pre-labeled with 20 M Calcein AM (Maokangbio, China). 

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Calcein AM /PI Cell Double Stain Kit (MX3012) and SYTO 9/Pl Live/Dead Bacteria Double Stain kit (MX4234) were purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, China);