Fluo-8, AM, Cell Permeant鈣離子熒光探針，超級純

（最亮的可見光鈣離子探針）

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（MS4301-1G）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

溫馨提示：見懋康生物MKbio整理的鈣離子熒光探針產品專題，選擇您想要的最適鈣離子探針。

衍伸提示：見懋康生物MKbio整理的鈉離子熒光探針產品專題，選擇您想要的最適鈉離子探針。

衍伸提示：見懋康生物MKbio整理的鉀離子熒光探針產品專題，選擇您想要的最適鉀離子探針。

搜索關鍵詞：

Fluo-8 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針；Fluo-2, AM；Fluo-2 Medium Affinity,Acetoxymethyl Ester；Fluo-3；Fluo-4；HTS Screen Assay 高通量篩選；

訂購信息：

產品描述

Fluo-8，是目前最亮的可見光激發波長Ca2+熒光探針，其熒光強度比Fluo-4強兩倍，比Fluo-3強四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+親和力，幾乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上幾乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，Fluo-4便捷的光譜檢測特性，與Ca2+結合后的最大激發波長為490nm，最大發射波長為514nm。而且具有改善的細胞載入和Ca2+響應能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4嚴格要求在37℃孵育，此特征使其更適用于HTS高通量篩選實驗。Fluo-8應用廣泛，與許多細胞系和靶向樣本兼容，不會受配體或靶標本身信號干擾。Fluo-8可通過激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光顯微鏡等來檢測胞內鈣離子水平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8，從而滯留在胞內以發揮相應生理功能。本品以50μg小包裝的凍干粉形式供貨，用于細胞內Ca2+水平檢測時，常用濃度為1-5μM。

基本特性：

1）  同義名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2）  化學名：Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3）  分子式：C50H50N2O23

4）  分子量：1046.93

5）  最大激發/發射波長：490/514 nm（Ca2+結合）

6）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7）  化學結構式：

保存與運輸方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

運輸：室溫運輸。

注意事項

1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）Fluo-8, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4）Fluo-8, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內使用。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據具體的實驗條件做出調整。

A、試劑準備

1. 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：MS4301-100MG）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1. 用無水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的儲存液，或將已配好的Fluo-8, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-8,AM中加入11.9μl無水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理緩沖液將Fluo-8, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10μM的工作液，提前加入適量的20% Pluronic F-127溶液，使其終濃度為0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

3.【可選】如果細胞內含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養基后需要重新調整pH。

4. 將準備好的Fluo-8, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。37℃或者室溫孵育20-60min。

【注①】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

【注②】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區室化現象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）替換，以去除多余探針。

6. 用適當的儀器如激光共聚焦、流式細胞儀、熒光酶標儀，以及波長Ex/Em=490/520 nm來進行檢測。

【注①】：Fluo-8, AM進入胞內后，經酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共價結合的形式滯留在細胞質內。因此不可對加載染料的活細胞進行固定處理，再進行Ca2+水平檢測。

— — Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作，主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。

引用文獻：

[1] Zhang X, Liu Z, Guo B, et al. Pharmacological Mechanisms of Periplocae Cortex Against Congestive Heart Failure  Based on Network Pharmacology and Experimental Evaluation. Natural Product Communications. 2024;19(3). doi:10.1177/1934578X241229289

The Fluo-8® AM fluorescent probe was acquired from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.

Determination of Intracellular Ca2+ Concentration

H9c2 cells were seeded into a 96-well plate at a density of 5?×?10³ cells/ well for 24?h. The cells were then pre-treated with BSS (5, 10, and 20?μM) for 2?h followed by exposure to 5?μM Dox for 24?h. Subsequently, DMEM basic culture medium supplemented with 4 μM Fluo-8® AM was added, and the cells were incubated at 37 ^oC for 30?min. The supernatant was discarded, and 100?μL PBS buffer containing 1?mM probenecid was added to reduce the leakage of the de-esterification probe. Fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 490?nm and an emission wavelength of 515?nm using a multifunctional microplate reader.

[2] Zhang Z, Luo Y, Ma Y, Zhou Y, Zhu D, Shen W, Liu J. Photocatalytic manipulation of Ca²⁺ signaling for regulating cellular and animal behaviors via MOF-enabled H₂O₂ generation. Sci Adv. 2024 Apr 19;10(16):eadl0263. doi: 10.1126/sciadv.adl0263. Epub 2024 Apr 19. PMID: 38640246; PMCID: PMC11029810.

Fluo-8 AM (#MX4505, Shanghai Maokang Biotechnology, 50 μg) 

Pluronic F-127 (#MS4301, Shanghai Maokang Biotechnology)

 The staining solution consisted of 4 μl of 1.5 mM Cal-520 AM solution in DMSO (#MX4537, Shanghai Maokang Biotechnology), 2 μl of Pluronic F-127 (#MS4301, Shanghai Maokang Biotechnology),