Zeocin (100mg/ml)  博萊霉素（100 mg/ml）

【溫馨提示】：如果你對市場上常見中文名都叫【博萊霉素】，但英文名又不同的一些產品感到有所迷惑，可參考我司【懋康生物】整理的Bleomycins (BLMs) 博萊霉素家族常用抗生素成員的應用選擇，也許有所收獲。

博萊霉素家族常見產品：

篩選抗生素：Zeocin【凍干粉】  Zeocin【100mg/ml】     Phleomycin 腐草霉素

細胞功能研究：Bleomycin Sulfate 硫酸博萊霉素     Bleomycin A5 Hydrochloride 鹽酸博萊霉素A5

產品標簽

Zeocin 博萊霉素（博來霉素）；Phleomycin 腐草霉素；Sh ble基因；Streptomyces verticillus 輪枝鏈霉菌；Hygromycin B 潮霉素B；G418遺傳霉素；CAS NO.：11006-33-0

產品信息

【提示1】：另現貨供應Invitrogen原裝進口的Zeocin（博來霉素）；

【提示2】：對Zeocin不敏感的細胞，如絲狀真菌和一些酵母菌，建議使用腐草霉素（貨號：MS0008-1ML），抗性基因同樣為Sh ble。

【提示3】：特價供應含Zeo+基因序列的質?！?— pcDNA 3.1/Zeo（+）（Invitrogen of Thermo），序列圖譜點擊下載文檔。

產品描述

Zeocin?是博來霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）抗生素家族的成員之一，從輪枝鏈霉菌Streptomyces verticillus中分離得到。作用譜廣泛，對細菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。

Zeocin?是腐草霉素D1的商業名稱，一種堿性、水溶性、銅離子螯合的糖肽抗生素。銅離子的存在使得溶液為藍色，此銅螯合的形式為無活性。當抗生素進入細胞后，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），并被細胞內的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導致細胞死亡。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性，該基因編碼一種13,665Da大小的蛋白，以化學計量方式結合Zeocin，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞被賦予Zeocin抗性。

本品為溶于去離子水的無菌溶液，濃度為100mg/ml，細胞培養級別。

產品特性

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化學式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外觀：藍色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

保存與運輸方法

保存：-20℃避光保存，至少1年有效，避免反復凍融。

運輸：冰袋運輸。

建議工作濃度

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養基）

3）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養基，根據細胞系而不同）

注意事項

1）Zeocin?對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養基置于黑暗處。

2）降低細菌培養基的鹽濃度，調整pH到7.5使其保持活性，因高離子強度和酸或堿性都會抑制Zeocin?活性。

3）儲存Zeocin?在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin?有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

5）Zeocin?是Invivogen公司的商標產品。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟（以哺乳動物細胞為例）

【注1】：Zeocin?的殺滅機制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），細胞不會聚集成團和從培養板表面脫落。一旦接觸到Zeocin?，敏感細胞會出現如下的形態變化：1）細胞體積明顯增加（類似于巨細胞病毒感染容納性細胞引起的腫大效應）；2）異常的細胞形狀包括細胞長臂（long appendages）出現；3）胞漿內出現大型空泡（源于內質網、高爾基體或支撐蛋白的破裂）；4）質膜和核膜破裂，導致膜上出現許多孔。這些敏感細胞最終會完全破損，僅僅以細胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin?抗性細胞按正常周期分化產生不同于敏感細胞的克隆?？剐约毎谛螒B上，與未接觸Zeocin?的正常細胞沒有任何差異。

【注3】：Zeocin?用于哺乳動物細胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml（平均常用濃度為250-400μg/mL），影響篩選濃度的主要因素包括離子強度，細胞類型，細胞密度以及生長速率。以下步驟僅作參考，請根據自身實驗體系做適當調整。

一、細胞對Zeocin?敏感性的確定（殺滅曲線建立）

1）重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養24h，去除舊培養基。

2）加入含不同濃度Zeocin?的篩選培養基，Zeocin?濃度可設置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個濃度做3個平行；也可根據自身實驗體系，設置不同的濃度梯度。

3）每3-4天更換新鮮的篩選培養基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適時間（1-2周內）殺死大多數細胞的濃度為最佳工作濃度。【注】：若是難以在顯微觀察下區分活細胞，建議使用臺盼藍染色來計算存活細胞的數量，以確定Zeocin?的最適濃度。

二、篩選穩定轉染細胞系

1）轉染細胞，用100mm培養皿進行培養。以未轉染的細胞作為陰性對照。

2）轉染后，用預熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養基。

3）轉染48-72h后，用含有最佳濃度Zeocin?（由滅殺曲線確定）的新鮮培養基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin?培養基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內終止細胞分化，使得Zeocin?能發揮作用，殺死細胞。

4）每3-4天更換新鮮的選擇培養基，直到出現細胞集落。

5）挑選并轉移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養板或培養皿上擴大培養之前，確保培養細胞密度近100%。

三、穩定轉染細胞系的維持培養

可采取以下方式維持培養穩定轉染細胞：

1）使用含相同劑量Zeocin?的篩選培養基來維持培養；

2）降低Zeocin?劑量為原來的一半進行維持培養；

3）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin劑量來維持培養【根據殺滅曲線來判斷】；

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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