X-α-Gal（α-半乳糖苷酶顯色底物/酵母雙雜交檢測）

— —酵母雙雜交檢測系統/蛋白-蛋白相互作用分析

搜索關鍵詞：

X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；α-半乳糖苷酶 a-galactosidase；MEL1基因；GAL4 酵母雙雜交系統；CAS：107021-38-5；藍白斑篩選；

基本描述：

X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一種用來檢測α-半乳糖苷酶（也稱為蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的顯色底物。X-α-Gal的使用，避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養基上，通過藍色沉淀的生成與否，即可用來檢測雙雜交相互作用。X-α-Gal可用來區分腸桿菌科內的不同物種以及劃分乳酸菌和雙歧桿菌。組織學研究中，X-α-Gal還可借助光學顯微鏡來檢測組織的α-半乳糖苷酶活性。

利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作為碳源，酵母菌得以正常生長或進行發酵。釀酒酵母菌內，該酶由幾種GAL基因調控的MEL1基因所編碼。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培養基上的X-α-Gal，使得菌落產生藍斑。酵母雙雜交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。

X-α-Gal優勢：

避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養基上，通過藍色沉淀的生成與否，即可用來檢測雙雜交相互作用。

X-α-Gal與酵母雙雜交系統：

酵母雙雜交篩選是體內用來檢測蛋白-蛋白相互作用的一種遺傳分析實驗，此方法由Prof. Stan Fields及合作者開發用來調查兩個已知蛋白的相互作用，另一個重要應用是從文庫內篩選并鑒定某一特定蛋白的未知結合蛋白。陽性克隆也就是那些能夠激活報告基因轉錄子，使得營養缺陷型酵母雙雜交菌株在營養缺陷選擇性培養基上生長的菌落。大多數雙雜交方法使用大腸桿菌的LacZ基因作為第二個報告基因，通常要使用非常耗時的filter-lift assay來鑒定能在第二種選擇性平板上生長的菌落。而替換使用的X-α-Gal，可直接在營養缺陷性的選擇培養基上來檢測基于GAL4-轉錄子的雙雜交作用。

基本特性：

1）  CAS NO：107021-38-5

2）  化學名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；

3）  分子式：C14H15BrClNO6

 4）分子量：408.64g/mol

5）純度：≥98%（TLC）

6）外觀：白色或近白色結晶粉末

7）化學結構：

使用方法【懋康整理】

方法1：直接倒入固體培養基

1）  溶解60mgX-α-gal于3ml DMF得20mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個月穩定；

2）  將高壓滅菌好的瓊脂培養基于室溫冷卻至50℃；

3）  按照每升培養基加入1ml 20mg/mlX-α-gal儲存液的用量，直接加入冷卻好的瓊脂培養基；【若有需要，此時也可加入篩選用的抗生素】；

4）  倒平板，使用前必須讓培養基室溫凝固（通常至少需30min）。

方法2：涂布于預制培養平板上

1）  溶解24mg X-α-gal于6ml DMF得4mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個月穩定；

2）  超凈工作臺內放置已經倒好的固體培養基，使其表面干燥；

3）  吸取200μl (15cm平板) 或100μl（10cm平板）4mg/ml X-α-gal 儲存液于預制培養平板上，并涂布使其均勻分散在表面【注意：平板邊緣通常很難得以充分涂布，可能導致假陽性克隆生成。建議條件可能下，于平板中央挑取克隆】。

4）  使用前將上述涂布好的篩選平板于超凈工作臺內，至少晾干30min；

5）  將轉化好的細菌或酵母涂于平板上，分別置于37℃或30℃倒置培養，直至藍色菌落出現。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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