近期有很多客戶使用我司（懋康生物）的Zymolyase-20T（酵母裂解酶，酵母溶壁酶）（Cat#：MF0212），經常問到產品如何溶解，使用劑量等問題，現對以下問題做出描述。有更多的問題，請和我司聯系，或發郵件到tech@maokangbio.com。
常見問題（Frequently asked questions）：
一、 產品如何保存？
答復：本品以凍干粉形式提供，收到產品需2-8℃干燥保存。本品置于30℃，3個月酶活力損失約70%。本品溶于緩沖液配制成儲存液后，短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長期請置于-20℃保存，約數月穩定。
二、 凍干粉如何溶解？
答復：本品易溶于水。建議用1/15M phosphate buffer（pH 7.5）溶解，或用自己實驗體系相關緩沖液來溶解。儲存液的制備方法比較多，主要根據自身的實驗體系，或參考文獻來操作。短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長期請置于-20℃保存，約數月穩定。
三、 如何制備無菌酶溶液？
答復：若需要制備無菌酶溶液，請用除硝酸纖維素膜之外的0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
四、 酶的比活力是多少？
答復：Zymolyase-20T指的是酶的比活力約20，000 units/g (20 Ku/mg)，具體批次酶的比活力是有變化的，詳細請見產品標簽或質檢報告。
五、 Zymolyase適用于哪些菌株類型？
答復：該酶的裂解譜（lytic spectrum）包含以下菌屬：Ashbya（阿舒囊霉屬）, Candida（假絲酵母菌屬）, Debaryomyces（德巴利（氏）酵母屬）, Eremothecium(假囊酵母屬), Endomyces(內孢霉), Hansenula(漢遜氏酵母), Hanseniaspora(孢漢遜酵母屬), Kloeckera(克勒克酵母屬), kluyveromyces（克魯維酵母屬）, Lipomyces(油脂酵母屬), Metschnikowia(梅奇酵母屬), Pichia(畢赤酵母屬), Pullularia(芽霉菌屬), Torulopsis(球擬酵母菌), Saccharomyces(酵母屬), Saccharomycopsis(復膜酵母菌屬), Saccharomycodes(類酵母屬), Schwanniomyces(許旺酵母菌屬)，等等。其他未羅列在內的菌屬請查閱文獻或和我司聯系是否有相關應用數據。
六、 Zymolyase適用于絲狀真菌嗎？
答復：該酶主要用于酵母細胞壁的裂解，對于絲狀真菌，雖然與酵母細胞壁在結構上有很多相似，但裂解效果因菌株類型有差異。建議用復合酶的形式來特異裂解絲狀真菌，或選用我司（懋康生物）提供的真菌溶壁酶（Cat#:MX7356）。
七、酶的工作濃度一般是多少？
不同的酵母菌株對酶的敏感性會有差異，請參閱文獻或根據實際的裂解經驗來設定合適的工作濃度。操作方法可參考下方流程。
操作步驟（僅作參考，實際應用可做適當調整）：
一、Zymolyase-20T儲存液制備
此配制方法針對以下步驟來設置，也可以適用其他適當的溶劑如1/15M phosphate buffer(pH 7.5) 、10mM Tris-HCl buffer（pH 7.5）等。
將低溫保存的凍干粉從冰箱取出，回置室溫，低速離心后，稱取適量粉末溶于無菌S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）配制成10mg/ml（200U/ml）儲存液，置于4℃能穩定保存2周（無菌條件下）。
二、制備原生質球（Spheroplasting protocol）
2.1 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物；
2.2 吸掉上清，收集離心沉淀（酵母細胞），記錄濕重；
2.3 用TE緩沖液（100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA）重懸酵母細胞，按照1.4ml/g濕重細胞加量。并用去離子水定容到終體積 3.5ml/g濕重細胞。
2.4 按照17.5 μl/g濕重細胞加入? -巰基乙醇，目的是為了除去細胞外層甘露聚糖層；
2.5 30°C孵育并保持低速搖晃，處于對數期生長的酵母孵育15min，處于穩定期生長的酵母孵45min；
2.7 用S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）重懸細胞，加4.0ml S緩沖液/g濕重細胞；
2.9 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）重懸細胞，另加入Zymolyases（50U/g濕重細胞，對200U/ml儲存液，則加入250μl）；初始用此酶，最好根據實際情況進行用量的優化。
2.10 30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下方式監測原生質球形成程度：
a）加1μl樣品到20μl S 緩沖液內，原生質球應該保持完整；b）加1μl樣品到20μl去離子水中，原生質球應該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品。
2.11 一般情況下反應45-60min，原生質球的形成量>90%，此時4oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；
2.12 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）重懸原生質球，5000rpm離心5min；重復此步驟2次。
2.13 原生質球沉淀可置于-70oC凍存。
三、酵母基因組DNA的制備（Preparation of yeast genomic DNA）
以下操作步驟簡單快速，適合于少量酵母培養物內基因組DNA的制備。
3.1 將過夜培養的10ml酵母菌培養物離心收集沉淀，加入280μl TE Buffer，300 μl 去離子水和3 μl ? -巰基乙醇；
3.3 30oC溫育45min；
3.3 以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀用500μl S 緩沖液重懸.；再次離心棄上清；
3.4 用500μl含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S緩沖液重懸沉淀（或者使用自行優化后的最佳酶濃度）；
3.5 30oC溫育1h；
3.6 重復步驟3.3；
3.7 用200μl含有0.1%SDS和2ug蛋白酶K的TE buffer重懸沉淀；
3.8 37oC溫育3小時，中間時不時的混勻下溶液；
3.9 轉到65oC溫育20min；從水浴鍋內取出并冷卻至室溫；
3.10 用200μl 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內取出并保留上清液；
3.11 用200μl氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；
3.12 加入500μl 95%乙醇到上清液內，20oC沉淀10min；
3.13 4oC下，15,000 xg離心20 min；
3.14 自然風干或者于真空離心蒸發濃縮器內晾干除去多余的乙醇，并加入200μl TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 μg RNase A）溶解DNA；
3.15 37oC溫育1小時；
3.16 重復步驟3.10和3.11；
3.17 加入2.5倍體積的95%乙醇，20oC沉淀10min；
3.18 30μl去離子水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據消光系數計算DNA產量；產量大約為40-50μg。
