專題關鍵詞：

Reducing agents 還原劑；DTT 二硫蘇糖醇；DTE 二硫赤蘚糖醇；TCEP Hydrochloride 三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽；GSH 還原型谷胱甘肽；GSSG 氧化型谷胱甘肽；Cleland’s reagent 克萊氏試劑；Antioxidant 抗氧化劑；GSH/GSSG；

基本介紹：

還原劑（Reducing agents）主要用于還原蛋白和多肽中的二硫鍵，也可用來降低蛋白聚集從而利于蛋白結晶。還原劑通常會與樣本中的金屬離子反應，導致還原劑性能降低。條件允許情況，可在體系中加入金屬螯合劑如EDTA，以去除所有不必要的金屬離子。然而，某些實驗有些酶功能的激活離不開金屬離子。像BME對銅離子、鈷離子和許多磷酸鹽緩沖液很敏感。DTT對鎳離子很敏感，因此，進行鎳離子相關的親和純化實驗要注意。還原劑的種類非常多。

生物化學和分子生物學中，常用的有BME（β-Mercaptoethanol，β-巰基乙醇），二硫蘇糖醇（DTT）和二硫赤蘚糖醇（DTE），和三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP-HCl），目前來說最受歡迎的莫過于DTT，已逐漸替換傳統的BME；而TCEP作為新開發的還原劑，也以更佳的穩定性、更廣的兼容性，和更高的還原能力，慢慢被科研工作者所重視，來替換DTT。

細胞生物學研究中，常用的為GSH（Glutathione, Reduced），一種極其重要的抗氧化劑，用以保護細胞和組織免受活性氧導致的損傷。GSH/GSSG比率是用來反映細胞和組織氧化應激的重要指標之一。

幾種還原劑的特征描述：

1. 巰基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME，BME）

典型特征：只含有一個巰基，還原性最差，還原作用只能維持2-3天，揮發性強。1970年前廣泛使用，由于惡臭（臭雞蛋味），之后迅速被DTT替代。溶液中BME一旦接觸空氣會迅速被氧化成一個二硫化物，特別堿性pH環境。正由于這一特性，BME廣泛用來保護蛋白，特別是酶，保持其活性。加入過量BME（通常0.01M）能維持蛋白巰基處于還原態。

應用：通常以5%濃度加入SDS-PAGE凝膠的上樣緩沖液。裂解分子間（亞基間）的二硫鍵從而使蛋白質亞基在SDS-PAGE上各自分開。裂解分子內（亞基內）的二硫鍵使亞基完全變性，從而保證每個肽按照其鏈長遷移而不受二級結構的影響。

2. 二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）

典型特征：含有二個巰基，還原性強于BME，作用能維持3-7天，揮發性弱。兩者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于β-巰基乙醇，且粉末的穩定性也高于β-巰基乙醇。DTT的最佳工作pH范圍為7.1-8.0，其在pH 6.5-9.0內都具有活性。通常情況，使用DTT (100 mM)所需的濃度是使用β-ME(5% v/v, 700 mM)所需濃度的七分之一。

應用：1）用作還原劑（通常用來還原蛋白和多肽中的二硫鍵，防止蛋白半胱氨酸殘基鏈間和鏈內的二硫鍵形成。）；2）用作抗氧化劑（保護活細胞免受離子輻射的傷害）；3）用作巰基化DNA的還原劑（巰基化DNA末端的硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是氧氣存在情況。二聚化能明顯降低后續偶聯反應的效率，比如生物傳感器金離子上的DNA固定化）；4）保持谷胱甘肽處于還原態；5）用作解毒劑（antidote）維持解毒系統的活性；5）參與細胞代謝比如囊泡形成，細胞形態特征，信號轉導通路（激素樣作用）等；6）用在如胱氨酸貯積癥，或由于離子或金屬毒性導致的疾病治療過程中。

3. 二硫赤蘚糖醇（Dithioerythritol，DTE）

典型特征：DTE是DTT的差向異構體（epimer），結構比較見下。

應用：同DTT，DTE也是一種優秀的還原劑，其還原性可能稍稍弱于DTT。

4. 三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP-HCl）

典型特征：TCEP，還原性最強，作用可維持2-3周。pH范圍廣，且無臭味。且兼容性好。在很多應用大已慢慢的替代DTT。

應用：1）用作還原劑（通常用來還原蛋白和多肽中的二硫鍵，防止蛋白半胱氨酸殘基鏈間和鏈內的二硫鍵形成）；2）用作許多重金屬離子如Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)和Ni(II)的螯合劑。

以下表1，是對DTT&TCEP的特征和功能的一一比較：

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5. 還原型谷胱甘肽（Glutathione, Reduced，GSH）

基本描述：

谷胱甘肽（Glutathione），一種小分子巰基多肽，在人體內以兩種形式存在，還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），兩者在相應的生理反應和酶催化下實現轉化，GSH/GSSG比率常用作反映細胞和組織氧化應激的一種重要指標。

還原性谷胱甘肽，英文名Glutathione, Reduced，縮寫為GSH，CAS NO. 70-18-8，普遍存在于動植物、真菌、一些細菌和古生菌中的一種重要抗氧化劑，保護細胞免受活性氧比如自由基、氧化物和脂質過氧化物造成的損傷。GSH是一種內源性三肽，發現于生物體內最主要的一種非蛋白硫醇，可提供電子還原細胞質蛋白通過半胱氨酸殘基連接形成的二硫鍵，維持蛋白的還原狀態。此過程中GSH也被氧化為GSSG。之后，通過谷胱甘肽還原酶（GS）的作用，以NADPH為電子供體，GSSG又被還原為GSH。GSH具有多種代謝、調控和保護功能。還可用作乙二醛酶I的抑制劑。

應用：

GSH用作還原劑，主要的功能也體現在細胞培養系統中。見下：

1. 保護細胞免受氧化應激帶來的損傷，使得胞內和胞內都保持在一種良好的氧化還原狀態。提供還原當量再生巰基化合物和抗氧化劑，同時轉化過氧化物到水或醇中。氧化型谷光氨肽（GSSG）能被谷胱甘肽還原酶快速還原，在正常的體內或者血清中幾乎沒有氧化形式的GSSG存在。

2. 谷胱甘肽是許多硒化蛋白的首選底物，在胞內和胞外環境起到解毒功能，通過將過氧化氫轉化為水，或者將有機過氧化物轉化為水和有機醇。若是不能去除，這些氧化物和過氧化氫最終會形成反應性的羥基、過氧和烷氧自由基。

3. 谷胱甘肽還原胱氨酸和半胱氨酸混合的二硫化物，產生半胱氨酸。保證半胱氨酸用作一種底物以形成蛋白，以及谷胱甘肽。

4. 谷胱甘肽再生抗血酸鹽，一種重要的維生素，參與銅離子動員，細胞貼壁，氨基酸代謝和抗氧化。間接有利于維持細胞膜的抗氧化活性。

5. 谷胱甘肽通過谷光氨肽S-轉移酶的作用，對脂質過氧化和/或糖氧化過程中產生的醛類進行解毒；

6. 谷胱甘肽可能用作一種非毒性和穩定的半胱氨酸儲存池，以進行蛋白合成；

7. 保證胞內蛋白巰基基團的還原態，從而有利于蛋白的分泌表達；

8. 某些細胞使用特殊的氨基酸膜轉運系統，其活性依賴γ-谷氨酰轉移酶。谷胱甘肽是其首選底物，有利于轉運其他氨基酸進入細胞。

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注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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