Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells

細胞線粒體分離試劑盒

產品信息

產品描述

細胞線粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells）是一款快速便捷的分離培養細胞內線粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線粒體的同時，還能獲得不含線粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素c等線粒體蛋白向胞漿的釋放。經本試劑盒獲得的大部分線粒體都含有完整的內膜和外膜，且維持線粒體生理功能，因此，分離所得的線粒體可用于線粒體膜電位等生理功能相關研究。另外，分離得到的線粒體也可被線粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

產品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   進行實驗之前務必閱讀試劑盒操作流程，根據最終實驗目的選擇試劑盒內所要用到的試劑。

2）   若不是用于制備線粒體蛋白樣品，不必往線粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3）   分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時間盡量控制在1h之內。

4）   通常，在分離線粒體時前后兩次離心速度選取1000g和15,000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5）   細胞計數（如臺盼藍染色）對于不同實驗不必全部使用，實驗條件成熟后可不用。

6）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

自備材料

1）（可選）胰酶-EDTA細胞消化液

2）（可選）臺盼藍染色液

3）（可選）BCA蛋白定量檢測試劑盒

4）PBS

5）低速離心機

6）勻漿器

使用方法

1.      試劑準備：從冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果實驗目的是為了制備線粒體蛋白樣品，需在線粒體裂解緩沖液和清洗液內添加PMSF (100×)，使其終濃度為PMSF (1×)。PMSF一定要在試劑加入到樣品前1-2min內加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2.      收集細胞：

2.1 對于貼壁細胞：用預冷的PBS清洗細胞1次，胰酶消化，100-200g 4℃離心5-10min收集細胞。

2.2 對于懸浮細胞：直接離心收集細胞。

3.      清洗：用預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，如有必要，取少量細胞用于計數。剩余細胞600g 4℃離心5min沉淀細胞，棄上清?！咀⒁狻浚簡蝹€樣品細胞量≥106個，一般控制在2-5×107個。

4.      裂解：往沉淀內加入1-2ml預冷的線粒體裂解液重懸細胞，冰內孵育10-15min，可用相差顯微鏡檢測細胞膨脹程度。

5.      勻漿：把細胞懸液轉移到Dounce勻漿器中，勻漿10-20次。不同細胞或不同勻漿器所需的勻漿次數有所不同，需自行優化?！咀⒁狻浚和ǔ?，可以在勻漿10次后取約2μl細胞勻漿，加入30-50μl臺盼藍染色液，混勻后顯微鏡下觀察臺盼藍染色陽性（藍色）細胞的比例。如果陽性細胞比例不足50%，增加5次勻漿。隨后再同前取樣進行臺盼藍染色鑒定。當陽性比例超過50%時即可停止勻漿進入下一步。請勿過度勻漿，過度勻漿會導致線粒體的機械損傷。同時記錄對于該細胞的勻漿次數，通常在后續實驗時不必再摸索勻漿次數。

6.       取勻漿液，立即加入等量清洗液，輕輕顛倒混勻數次。

7.       4℃ 1300g離心5min以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片。

8.       上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 1000g離心5min，重復2次。

9.       上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 12000-15000g離心15min，重復1次。

10.    棄上清，沉淀即為線粒體。需注意，如果希望獲得去除線粒體后的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，且在收集上清的過程中不要觸及沉淀，隨后把收集的上清4℃ 12000g 離心10min，此時即得到去除線粒體的細胞漿蛋白。

11.    保存：棄上清，用適當的緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能分析，線粒體沉淀需重懸于線粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應保存于蛋白保存液（1×），即按照：細胞漿蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應使用其它適宜的保存液。

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