PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記）

產品關鍵詞：

PKH67；PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking體內細胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

產品信息

【好消息】：應客戶的要求，我司對試劑盒內的Diluent C可單獨供應，產品信息如下：

產品描述

PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于熒光探針PKH67，用于常規細胞膜標記的檢測試劑盒，適用于體外細胞標記，體外細胞增殖以及長期的體內細胞跟蹤研究等。

PKH67是一種專利的膜標記探針，與PKH1和PKH2相比，結構上帶有更長的脂肪族碳尾，能穩定插入細胞膜脂質區域。正因具更長碳尾，內部數據連續性證明：PKH67具有比PKH2更低的細胞-細胞間轉運發生。PKH67呈綠色熒光（見圖1），最大激發波長為490nm，最大發射波長是502nm，與標準熒光素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常適合用于細胞毒性實驗，與碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放線菌素D（7-AAD，MX4215）這些細胞活力探針聯合使用，或者與橙-紅色熒光探針比如藻紅蛋白（PE，MX4698）、紅色熒光蛋白（RFP）等結合使用。根據染料稀釋原理，PKH67常用于細胞增殖監測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶干細胞特性的靜息/緩慢分化腫瘤細胞的鑒定。也能用于監測外泌體或脂質體吞噬，細胞-細胞膜轉運、吞噬、抗原遞呈，以及體內細胞運輸研究。

以不分裂細胞為研究對象，通過對體外細胞膜滯留周期和體內熒光強度減弱頻率的關聯性分析，預測PKH67的體內熒光半衰期為10-12天。這與PKH1和PKH2的體內半衰期相近，這兩個探針都成功用于監測周期長達1-2個月的體內淋巴細胞和巨噬細胞運輸研究，因此，PKH67適用于需要綠色熒光細胞連接染料的短-中期體內示蹤研究，以及體外細胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養實驗。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一種水溶性溶液，特別設計的一種標記媒介能維持細胞活力，同時最大化染料溶解性和標記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動物細胞來說是等滲的，不含去污劑或有機溶劑，也不含生理鹽和緩沖劑。根據細胞類型，染料標記后膜的內在化程度，標記細胞可能呈現不同的狀態，從明亮，到均勻點狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光在生理范圍內不依賴于pH，且每個細胞的熒光強度通常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發和發射光譜圖

我司（懋康生物）提供三種規格的PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建議用于小量或初步研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于5次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定最佳的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）適用于中量研究，比如體外細胞增殖或毒性研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定最佳的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）適用于大量或體內研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定最佳的染料濃度。

產品包裝

保存與運輸方法

保存：2-8oC避光保存，1年有效。其中組分A（PKH67 Dye）需嚴格避光，蓋子保持擰緊。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1. PKH67是以溶于乙醇的儲存液形式提供，保存的過程中需避光并擰緊蓋子，以防止溶液揮發引起的染料濃度提高。使用前需檢查是否有結晶，若有結晶，需在37℃水浴溶晶，超聲或渦旋直至完全溶解。

2. Diluent C使用前需置于室溫回溫之后再配制標記用的細胞和染料工作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生素，使用和保存過程中都注意無菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C內，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，現配現用。

4. 熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 自行準備儀器和試劑（試劑盒不提供，用于常規細胞膜標記）

﹒良好分散，均勻的單細胞懸液（懸浮于組織培養基）

﹒含血清的組織培養基（完全培養基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養基，或生理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系統兼容的蛋白

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能控溫的離心機（高達1000×g）

﹒熒光分析用儀器（熒光酶標板，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

﹒無菌層流凈化罩

﹒血球計數板或自動細胞計數裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規細胞膜標記

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×107個細胞/ml。

以下所有步驟都在室溫下進行（20-25℃）。

1. 取一錐底聚丙烯離心管制備2×107個細胞的單細胞懸浮液，用無血清培養基清洗細胞一次。

2. 400×g離心細胞5min，得到松散的細胞沉淀。

3. 細胞離心后，輕輕吸掉上清。注意不要移動任何細胞并且殘留不超過25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到細胞沉淀中制備成2×細胞懸液，用槍輕輕吹勻以確保完全分散。不可渦旋和不可讓細胞長期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通過將4μl PKH67乙醇儲存液到1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細胞懸液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本?；靹蚝髽颖镜玫降慕K濃度是1×107個細胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非?？?，更長時間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他適當蛋白溶液（比如1% BSA）終止染色，孵育1min允許結合多余的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細胞10min，輕輕吸掉上清，確保不會移動細胞。用10ml完全培養基重懸細胞，轉移到一個干凈無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細胞5min。然后用10ml完全培養基清洗細胞沉淀＞2次，以確保完全去除未結合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完全培養基重懸細胞沉淀，用來評估細胞回收，細胞活力和染色強度。離心和重懸沉淀到一理想終濃度的活細胞懸液。

染色示例（來自文獻資源）

1）文獻來源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：為了評估旁觀者凋亡效應，靶向THP-1單核細胞用PKH67來標記，最終在熒光顯微鏡觀察以確認標記是否成功。標記好的THP-1細胞（未感染的旁觀者細胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬細胞（感染效應細胞量：0.5 × 105cells/ml），接種到2孔的LabTek腔室玻片。效應巨噬細胞經H37Ra感染4h，之后劇烈清洗去除胞外細菌。之后與未感染的PKH67標記旁觀者細胞共培養，37℃共培養24或48h。孵育后，上清液去除，細胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR監測凋亡，細胞核用Hochest 33342復染。用熒光顯微鏡來評估綠色PKH67標記巨噬細胞的旁觀凋亡效應。當某一個單細胞同時呈綠色（旁觀者）和紅色（凋亡），表明旁觀者凋亡效應的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文獻來源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和細胞因子刺激30min，之后，將1 × 106PKH67標記好的凋亡自體中性粒細胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，紅細胞用裂解液裂解掉，流式細胞術觀察中性粒細胞內凋亡細胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

相關產品

延伸閱讀（懋康生物獨家整理）

鑒于近期大量的用戶咨詢PKH26用于外泌體染色（exosome stain）的方法，我司查閱相關文獻資料，提供染色相關的一些信息，僅供交流學習用。

摘自文獻1）Pu?ar Dominku? P et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2018 Jun;1860(6):1350-1361. PMID: 29551275

◇◇ 外泌體染色（Exosome staining）(簡單流程見Fig 1)

外泌體凍干標準用超純水重懸制備成1.0μg/μL溶液，之后用PKH26紅色熒光檢測試劑盒來標記。染色前，溶于Diluent C的PKH26在超純水水浴鍋于37℃孵育15min。對于對照樣品，用不含顆粒的DPBS來替代外泌體標準。

① 染色流程A

PKH26用100μL diluent C稀釋使其終濃度為8μM（染料濃度）。之后10μg外泌體（in 20μL DPBS，MKBio）用80μL diluent C稀釋，加入染料溶液內，孵育5min，同時用槍輕輕混勻。用100μL不含外泌體的10% FBS (in DMEM，MKBio)來結合多余的染料。之后，外泌體用1ml DPBS稀釋，4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS輕輕重懸。

② 染色流程B

外泌體的染色方法同流程A。之后稀釋到2ml DPBS，轉移到Vivaspin20 300-kDa MWCO filters，于4°C（4000×g）離心3min，之后用2ml DPBS清洗3次，最終用沉淀用50μL DPBS輕輕重懸。

③ 染色流程C

外泌體的染色方法同流程A。之后稀釋到10ml DPBS，置于2ml 20%蔗糖（in DPBS，，MKBio）的上層。外泌體用4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS輕輕重懸。

④ 染色流程D

外泌體的染色方法同流程A。之后稀釋到400μL DPBS，置于20%~60%非連續蔗糖梯度（in DPBS）的上層。外泌體用4°C超速（100000×g，MKBio）離心18h。分層3-6（密度范圍1.08–1.15g/mL）吸在一起，分層7-10（密度范圍1.17–1.23g/mL）吸在一起，每一份都稀釋到30ml DPBS。外泌體用4°C超速（100000×g）離心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS輕輕重懸。

Fig. 1. Schematic representation of staining procedures used to label exosomes with PKH26 dye. Exosomes (exo) were labeled using staining procedures based on ultracentrifugation (procedure A), filtration through Vivaspin concentrators (procedure B), and sucrose cushion (procedure C) and sucrose gradient (procedure D) purification. Key differences between the procedures are highlighted by the green text.

◇◇ 外泌體檢測（Confocal microscopy）

取小體積（6μL）輕輕混勻的PKH26標記對照和外泌體樣本分別轉移到包被有10%多聚L-賴氨酸的蓋玻片上，然后封固在載玻片上，然后轉移到共聚焦顯微鏡下觀察。用561nm diode-pumped solid state laser line觀察，用565nm-605nm寬帶濾片來檢測發射光。

◇◇ 外泌體染色結果分析

針對幾種染色流程，發現①超速離心為基礎的外泌體染色會產生大量的PKH26納米粒子（nanoparticles），直徑類似于PKH26標記的外泌體。②基于過濾（filtration）為基礎的外泌體染色法典型的特征是PKH26標記顆粒的回收率低。③通過蔗糖緩沖層純化的PKH26標記納米粒子和PKH26標記外泌體根據大小能區分開。④PKH26標記納米粒子和PKH26標記外泌體通過進入濃縮蔗糖梯度層能分開。

摘自資料2）來自網絡資源。

PKH染料（常用的有PKH26-MX4021和PKH67）大量文獻用來標記外泌體和胞外囊泡進行體外和體內示蹤實驗。以下步驟可參考用于外泌體標記以進行微囊泡示蹤實驗。

外泌體標記步驟：

（1）利用超速或微過濾的方式制備新鮮的外泌體沉淀。

（2）超速離心機冷卻到2-8℃。將每個樣本的多管離心沉淀聚合在一起，之后測定總體積。

（3）用Diluent C, MX4022將所有體積的沉淀稀釋到高達1ml。

（4）確定最大體積的沉淀樣本，加等體積的不含外泌體的培養基到一個新管內，用Diluent C稀釋到1ml。

（5）加6μLPKH26到1ml Diluent C管內（步驟3和步驟4）。

（6）用槍連續性輕輕混勻30s。室溫靜置5min。

（7）加入含2ml 10% BSA（in PBS）來淬滅反應。用無血清培養基定容體積到8.5ml。

（8）制備0.971M的蔗糖溶液。用槍緩慢吸取1.5ml蔗糖溶液，加到管子底部，確保不會產生震蕩。外泌體-PKH26 MX4021標記溶液加在蔗糖緩沖層（sucrose cushion）的上方。

（9）于2-8℃超速（190,000 G）離心2h?！缸⒁猓和饷隗w在沉淀內，絕大部分多余的染料在中間層」。小心吸取培養基和中間層。

（10）輕輕用槍將外泌體沉淀重懸在1X PBS。

（11）轉移到Amicon 10kDa MWCO超濾管內。加9ml PBS，0.75ml培養基。

（12）于3000 x g離心40min，使得最終保留體積在0.5-1mL。

（13）從Amicon超濾管內吸取濃縮液，保存在冰上。盡快于合適的儀器下分析熒光信號。

[1] Yan, F., Cui, W. & Chen, Z. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosome-Loaded microRNA-129-5p Inhibits TRAF3 Expression to Alleviate Apoptosis and Oxidative Stress in Heart Failure. Cardiovasc Toxicol 22, 631–645 (2022). https://doi.org/10.1007/s12012-022-09743-9

（染色對象：外泌體）

After thawing, the isolated MSC-Exos were labeled using a PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (MX4023, Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China).

[2] Jiao W, Hao J, Liu JM, Gao WN, Zhao JJ, Li YJ. Mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicle-incorporated H19 attenuates cardiac remodeling in rats with heart failure. Kaohsiung J Med Sci. 2024 Jan;40(1):46-62. doi: 10.1002/kjm2.12774. Epub 2023 Oct 27. PMID: 37885317. （染色對象：細胞外囊體EV）

To observe the uptake of EV by H9C2 cells, we labeled and resuspended MSC-EV in DMEM using the PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling kit (Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) according to the protocol. 

[3] Pan G, Jiang B, Yi Z, Yin J, Liu Y. Exosomal miR-105-5p derived from bladder cancer stem cells targets for GPR12 to promote the malignancy of bladder cancer. BMC Urol. 2023 Oct 3;23(1):155. doi: 10.1186/s12894-023-01326-2. PMID: 37789353; PMCID: PMC10548737.

（染色對象：外泌體）

PKH67 staining assay

Exosome uptake of EJ and T24 cells was analyzed by PKH67 staining assay using the kit according to the manual (MX4023-100UL; Shanghai Maokang Biotech Co., Ltd.). Briefly, 2 × 10⁷ exosomes were collected and resuspended in 1 ml Diluent C. 4 μl of PKH67 solution was added into the resuspension and incubated for 5 min. Then, the PKH67-labeled exosomes were incubated with EJ and T24 cells for 24 h and the cellular location of the exosomes was observed by a fluorescence microscope. DAPI was used to stain the nuclei of the tumor cells.

[4] Wu R, Li J, Aicher A, Jiang K, Tondi S, Dong S, Zheng Q, Tang S, Chen M, Guo Z, ?abanovi? B, Ananthanarayanan P, Jiang L, Sapino A, Wen C, Fu D, Shen B, Heeschen C. Gasdermin C promotes Stemness and Immune Evasion in Pancreatic Cancer via Pyroptosis-Independent Mechanism. Adv Sci (Weinh). 2024 Sep 19:e2308990. doi: 10.1002/advs.202308990. Epub ahead of print. PMID: 39297408.

（染色對象：巨噬細胞）

In Vitro Macrophage Phagocytosis Assay

PBMC, immortalized Bone Marrow-Derived Macrophage (iBMDM) cells, or THP-1 cells activated with PMA (#S1819, Beyotime, 100 ng mL^?1 for three days) were labeled with PKH26 (#MX4021, MaokangBio), while cancer cells were labeled with PKH67 (#MX4023, MaokangBio), following the manufacturer's instructions. The macrophages were then mixed with the cancer cells at a ratio of 2:1 and seeded onto a 6-well plate. Images were taken at the indicated time points, and the phagocytic index was calculated as the number of phagocytosed cancer cells per 100 macrophages. For anti-CD47 antibody treatment, 10 μg mL^?1 anti-CD47 antibody or isotype IgG was added to the co-culture medium of CHX2000 cells and iBMDM cells at a 1:1 cell ratio. Cancer cell confluence was determined by fluorescent imaging and quantification.

[5] Yao F, Zhao Y, Wang G, Zhao M, Hong X, Ye Z, Dong F, Li W, Deng Q. Exosomal lncRNA ROR1-AS1 from cancer-associated fibroblasts inhibits ferroptosis of lung cancer cells through the IGF2BP1/SLC7A11 signal axis. Cell Signal. 2024 Aug;120:111221. doi: 10.1016/j.cellsig.2024.111221. Epub 2024 May 8. PMID: 38729321.

（染色對象：外泌體）

Exosomes and PKH67 (MX4023, MaoKangBio, Shanghai, China) were diluted, respectively, using diluent C (1 mL, MX4022, MaoKangBio).

[6] DnaK of Parvimonas micra OMVs interacted with the host fibroblast Bag3-IKK-γ axis to accelerate TNF-α secretion in oral lichen planus

Besides, they underwent overnight incubation at 4°C with antibodies against pkh67 (maokangbio, Shanghai, China), β-Tubulin (CST, California, the USA), Bag3 and IKK-γ, and then 1-hour incubation with Alexa Fluor 488/594-labelled goat anti-mouse/rabbit immunoglobulin G (IgG) (Abbkine, California, the USA) at 37°C in the dark.

[7] Wang H, Chen L, Li R, Lv C, Xu Y, Xiong Y. Polydopamine-coated mesoporous silica nanoparticles co-loaded with Ziyuglycoside I and Oseltamivir for synergistic treatment of viral pneumonia. Int J Pharm. 2023 Oct 15;645:123412. doi: 10.1016/j.ijpharm.2023.123412. Epub 2023 Sep 12. PMID: 37703956.

The PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (MX4023) was purchased from Maokang Biotechnology Co. Ltd. (China). 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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